玉米赤霉烯酮(Ⅰ型)ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

玉米赤霉烯酮(Zearaleaone)又稱F-2毒素，是玉米赤霉菌的代謝產(chǎn)物，具有雌激素樣作用，具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發(fā)生雌激素亢進癥，導(dǎo)致動物不孕或流產(chǎn)，對家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。

【適用范圍】

可定性、定量檢測谷類、啤酒及飼料等樣本中的玉米赤霉烯酮殘留量。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預(yù)包被玉米赤霉烯酮抗原，加入樣本/玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的玉米赤霉烯酮與預(yù)包被在微孔板上的玉米赤霉烯酮抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的玉米赤霉烯酮抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物玉米赤霉烯酮抗原的含量成負相關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物玉米赤霉烯酮的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：0.2ppb

【交叉反應(yīng)率】

   結(jié)構(gòu)類似物                                                               交叉反應(yīng)率

  玉米赤霉烯酮   ……………………………………………………………  100%

  α-玉米赤霉醇  ……………………………………………………………   75%

  β-玉米赤霉醇   ……………………………………………………………   61%

  α-玉米赤霉烯醇  …………………………………………………………  103%

  β-玉米赤霉烯醇  ……………………………………………………………  83%

  玉米赤霉酮   …………………………………………………………………  75%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb, 0.2ppb, 0.6ppb, 1.8ppb, 5.4ppb, 16.2ppb

3. 酶標(biāo)物 1瓶  ………………………………………… 7ml

4. 顯色液1瓶  ………………………………………… 12ml

5. 終止液1瓶  ………………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶 ……………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×） 1瓶………………… 20ml

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅粉碎機

┅┅離心機

┅┅天平：感量0.01g

┅┅微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl

試劑：

-----甲醇

----去離子水（或蒸餾水）

【試劑配制】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。

3. 50％甲醇：取無水甲醇，用去離子水以1:1體積比例稀釋（1份無水甲醇＋1份水）。

4. 40％甲醇：取無水甲醇，用去離子水以4:6體積比例稀釋（4份無水甲醇＋6份水）。

【樣本前處理步驟】

一、 谷物（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取1g粉碎樣品，加入4ml 50％甲醇；

2. 劇烈振蕩5min；

3. 4000g離心5min；

4. 取上清液400μl，加入600μl樣本稀釋液，混勻；

5. 取稀釋后液體待測。

二、啤酒（稀釋倍數(shù)：10）

1. 取待測啤酒，除凈氣體（60℃水浴或振蕩去除）；

2. 取1ml啤酒，加入4ml40%甲醇；

3. 劇烈振蕩5min；

4. 取上述液體500μl，加入樣本稀釋液500μl，混勻；

5. 取稀釋后液體待測。

三、飼料（稀釋倍數(shù)：200）

1. 取0.5g粉碎樣本，加入20ml無水甲醇；

2. 充分振蕩5min；

3. 5000rpm離心5min；

4. 取上清液100μl加入樣本稀釋液400μl混勻；

5. 取稀釋后液體待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。

3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。

【結(jié)果判定】

1. 百分吸光率的計算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋