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常見問題

單抗制備常見問題分析
時間:2015-01-06 17:28:34 作者: 來源:轉(zhuǎn)載 點擊:1303次

1.  為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低?


答:可以從這幾個方面一一考慮:


(1)設(shè)計的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計抗原,設(shè)計抗原時盡量選取目標(biāo)蛋白特異性的序列,可以設(shè)計為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫;對于后一種情況,首先確認(rèn)小分子物質(zhì)是否已經(jīng)正確地和載體蛋白偶聯(lián),如果偶聯(lián)沒有問題,可以更換其它的載體蛋白,一般來說KLH是所有載體中較為優(yōu)先考慮的蛋白。


(2)免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短,各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果,詳細(xì)請參考本站有關(guān)動物免疫的部份,實際操作中的相關(guān)程序與本站推薦的程序相差盡里不超過50%的偏差。


(3)免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時,對于某些抗原可能效果不佳,弗低佐劑也不能保證完全有效,此時可以考慮更換佐劑嘗試。


(4)免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導(dǎo)致免疫耐受,過少的免疫劑量可能無法激活免疫應(yīng)答。一般來說,實際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。


(5)免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原,可以考慮脾內(nèi)免疫方法,具體操作本站上也有詳細(xì)的講解。


(6)測效價的過程存在錯誤操作,尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時,一抗(即血清)稀釋梯度盡量放寬,一般建議從1:500或1:1000開始作梯度稀釋。對于小分子物質(zhì),效價達到1:2000仍可視為免疫成功。


2.  為什么融合后細(xì)胞不長或者融合后克隆很少?


答:可以從這幾個方面考慮:


(1)免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應(yīng)該與骨髓瘤來源的動物是相同品系,例如使用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時應(yīng)該選用Balb/C小鼠,同時必須使用品系純正的小鼠。


(2)培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT,或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低,建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。


(3)培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。


(4)未正確制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。參見本站有關(guān)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備的部份。


(5)接種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。


(6)融合后,未及時轉(zhuǎn)移或稀釋細(xì)胞。有人在做融合后喜歡把融合的細(xì)胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),然后再滴到96孔板上。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時間過長,也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。


(7)細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物,也應(yīng)該考慮是否有支原體污染,有條件的可以做支原體檢測。


(8)細(xì)胞培養(yǎng)條件不正確,確保細(xì)胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境,同時保證CO2濃度在4-5%左右。


(9)其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩亍T斠姳菊居嘘P(guān)細(xì)胞融合的部份。


3.  為什么融合后得不到陽性克???


答:可能的原因:


(1)動物未免疫成功就進行了融合。具體解決方法參照本頁面第1個問題。


(2)融合后得到的克隆較少,故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法,請參照本頁面第2個問題。


(3)篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標(biāo)板上,再如使用了不適當(dāng)?shù)亩沟戎T多因素,也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的,成功率也有待商榷。


(4)抗原成份與細(xì)胞培養(yǎng)條件中的物質(zhì)相同或類似,或者與篩選過程中有同抗原結(jié)構(gòu)相同或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反應(yīng)。舉個簡單的例子,如果需要制備抗BSA 的單抗,則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清,否則牛血清中的BSA直接與抗體相結(jié)合,最后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結(jié)果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養(yǎng)基。再如,如果需要制備酪蛋白的單抗,則做ELISA篩選時,二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。


(5)其它所有能影響ELISA等相關(guān)篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關(guān)ELISA實驗的講解與討論。


4.  為什么我的細(xì)胞生長很慢?


答:可能的原因:


(1)使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清,可能需要從多個廠家選用多個批次試用,選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候,一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗,根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實血清質(zhì)量。


(2)使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方是否正確。


(3)制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見本頁面第二個問題。


(4)其它問題,可以參考本頁面第二個問題。


5.  我的克隆原來是陽性的,為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了?


答:首先要注意的是,正常情況下,雜交瘤也不是絕對穩(wěn)定的,確實容易發(fā)生染色體丟失的情況,尤其是當(dāng)細(xì)胞移到新環(huán)境中生長,如從小孔擴大到大孔,或者復(fù)蘇操作時,更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮?。但是也有一些辦法盡量減少陽性變?yōu)殛幮缘霓k法。一般可以從這幾個方面加以注意:


(1)永遠(yuǎn)保證細(xì)胞處在最佳的生長環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長期不換,一般來說,當(dāng)細(xì)胞增長到一定密度的時候,培養(yǎng)基就開始變顏色,這個時候就要準(zhǔn)備換培養(yǎng)基了,除了換培養(yǎng)基,同時應(yīng)該控制好細(xì)胞的密度,可以吹走過多的細(xì)胞,使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。


(2)對于重要的細(xì)胞株,每一步都把陽性的細(xì)胞保種。


(3)不要過于頻繁操作細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長密度不是很大的時候,不要頻繁操作,否則細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。


(4)對于傳代次數(shù)較多的細(xì)胞株需要經(jīng)常進行亞克隆,并將每一次的亞克隆株也作凍存。


(5)當(dāng)細(xì)胞被支原體等微生物污染,也會發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的情況。


6.  為什么我做亞克隆后長不出克隆來?


答:亞克隆失敗的原因和克隆不長的原因類似,但是除此之外,也還有一些獨特的原因。


(1)亞克隆時,原始孔里的細(xì)胞狀態(tài)不好,經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細(xì)胞活性很差,以至于長不出克隆。


(2)亞克隆時,沒有按照正確的數(shù)量取出細(xì)胞,在本站有關(guān)亞克隆操作的頁面上提到過,亞克隆的過程服從泊松分布,如果取出的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞,或有效細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞,則也可能出現(xiàn)長不出克隆的結(jié)果。


(3)未添加飼養(yǎng)層細(xì)胞。單個細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中極難培養(yǎng),如果不添加飼養(yǎng)層細(xì)胞,則它們很可能很快就死亡,最終就長不出克隆。


(4)使用的HAT中HT失效或A的濃度過高,或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的,但是HT確實可以加快細(xì)胞生長,改善細(xì)胞生長狀態(tài)。


(5)使用無血清培養(yǎng)基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養(yǎng)基制備單抗,但是在某些血清可能干預(yù)篩選步驟的實驗的時候,可能會選用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)雜交瘤,但是需要注意的是,在很多種無血清培養(yǎng)基中,單個細(xì)胞是很難長成克隆的。最好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們,等克隆長出后再把培養(yǎng)基徹底更換為無血清培養(yǎng)基。


7.  為什么我凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活?


答:這個問題要從兩個方面來回答,一是凍存方面,二是復(fù)蘇問題。 對于凍存過程,需要注意:


(1)凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵,一個良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保存得非常好,而一個不好的凍存液配方可能會讓細(xì)胞傾刻死亡。目前認(rèn)為比較好的配方有:10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基,不管是哪一種,凍存保護劑DMSO的含量非常重要,如果這個濃度過低,則起不到保護作用,凍存的細(xì)胞最終會死于冰晶形成時的張力,如果濃度過高,則細(xì)胞中毒而亡。如果使用第二個配方,注意一定要用養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基,而盡量不要用一般的完全培養(yǎng)基,而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的,站長自己沒有親自試過,不發(fā)表評論。如果新手確實對這個沒把握,市場上也有商品化的凍存液,買回來按照說明書操作就OK了。


(2)凍存過程中,不可用力過大,在凍存液中重懸細(xì)胞的時候更是要輕柔,因為在DMSO存在的條件下,細(xì)胞膜變得非常脆弱,如果用力過猛,則細(xì)胞膜很容易破,復(fù)蘇成活的機會就明顯會下降。


(3)凍存的程序也非常重要。實踐表明,以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細(xì)胞是最理想的。如果條件簡易,可以把細(xì)胞放在4 ℃半小時左右,然后再在-20 ℃放置1-2小時,最后轉(zhuǎn)入-80 ℃放置過夜,最終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的,直接放-80 ℃也行。現(xiàn)在市場上有比較貴的凍存盒,把需要存放的細(xì)胞放進去,然后直接放-80 ℃就行,等時間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。


(4)細(xì)胞需要保存在液氮的氣相中,而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意,大部份人都是直接往液相里放,其實這是錯誤的。有人認(rèn)為,普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的,如果放在液相中,這些微生物或孢子就有機會進入凍存管,最終可能造成細(xì)胞污染。


(5)保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài),并且沒有被污染。


對于復(fù)蘇過程,需要注意:


(1)快速。為了防止升溫中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶,強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復(fù)蘇,并不斷晃動凍存管。


(2)復(fù)蘇過程不要把凍存管全部泡入水中,也不要把蓋子弄濕,否則熱水有可能污染管口,造成復(fù)蘇的細(xì)胞被污染。


(3)有的人復(fù)蘇細(xì)胞時,沒有去掉凍存液,這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養(yǎng)體系里,容易對細(xì)胞造成毒害,因此強烈建議將融化的細(xì)胞離心后去掉凍存液,然后用新的完全培養(yǎng)基重懸,再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。


8.  為什么我的細(xì)胞總是污染?如何可以救活污染的細(xì)胞?


答:養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)污染,幾乎是每個細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)員容易出現(xiàn)的問題。要防止細(xì)胞污染,無非就是保證培養(yǎng)環(huán)境無污染,保證所用的所有試劑都無污染源,同時提高操作時的警惕性,這些基本的知識這里就不再廢話了。下面講一講如何挽救一株已經(jīng)被污染的細(xì)胞株。


(1)體外用抗生素消滅。一般來說,一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被微生物污染,應(yīng)該馬上進行處理,也許還有一線挽救的機會。 但是這種挽救不是盲目的,首先應(yīng)該決斷是哪一類生物造成的污染。細(xì)胞的污染大致可以分三類:細(xì)菌污染、真菌污染和支原體污染。 在顯微鏡下仔細(xì)觀察,這三種微生物污染區(qū)別還是比較明顯的:如果有大量運動的微生物,且形態(tài)較大,輪廓清晰可見,呈較大幅度運動,并且培養(yǎng)基在短時間內(nèi)變酸,則很可能是細(xì)菌污染;如果在顯微鏡下觀察有典型的斑狀或絲狀微生物(注意與塑料屑、棉花屑和琉璃纖維區(qū)別開),基本上看不到明顯的運動,則很可能是真菌污染;如果看不到明顯的微生物,并且培養(yǎng)基沒有明顯的顏色上的變化,而細(xì)胞狀態(tài)很差,細(xì)胞邊緣極其不光滑,而且細(xì)胞又莫名其妙地死亡或生長極其緩慢,則有可能為支原體污染,但不能下明確的結(jié)論,如果非常需要知道是否為支原體污染可以使用相關(guān)的試劑盒進行檢測。 對于細(xì)菌或真菌的污染,可以先把細(xì)胞收集起來,用干凈的培養(yǎng)基洗滌離心,交替進行幾次,再把洗干凈的細(xì)胞放在新的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶等容器內(nèi),加高濃度的抗生素培養(yǎng),同時強烈建議加入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,以輔助消除微生物。對于細(xì)菌污染,可以把青霉素的濃度提高至10倍左右,鏈霉素濃度提高至5-10 倍,也可以用10倍濃度的卡那霉素替代鏈霉素。 對于真菌污染,可以在培養(yǎng)基中加入約5 ug/ml的咪康唑(注射用達克寧)抑制。 對于這兩種情況的污染,采用上述方法處理后,待細(xì)胞稍有好轉(zhuǎn),并且沒有發(fā)現(xiàn)更大規(guī)模的污染時,需要盡快重復(fù)上面的處理步驟。需要注意的是,此時細(xì)胞生長受抗生素的影響比較大故而生長很慢。如果多次傳代均未發(fā)現(xiàn)污染復(fù)發(fā),可以慢慢降低抗生素濃度直至常規(guī)濃度,確定是否完全根除污染。最好進行一次有限稀釋的亞克隆操作,以獲得更加純凈的細(xì)胞株。 而對于支原體污染,則比較麻煩,一般的抗生素是很難解決的,對于輕度的污染,可以試試使用60 ug/ml的泰樂菌素和10 ug/ml左右的環(huán)丙沙星交替處理。如果得到明顯的緩解,建議馬上做亞克隆操作,看看是否得到污染根除的細(xì)胞株,如果此方法無效,則不能單純利用抗生素來解決污染問題。


(2)體內(nèi)法。這個辦法很簡單,原理就是動物體有強大的免疫系統(tǒng),一般的微生物都可以被動物體消滅。具體操作和制備腹水的方法完全一樣,即先用IFA或石蠟制敏小鼠,數(shù)天后腹腔注射污染的雜交瘤。如果情況緊急,致敏當(dāng)天注射雜交瘤也行。一般十天后小鼠產(chǎn)生腹水,在超凈臺無菌采出腹水,其中即含有大量的雜交瘤細(xì)胞,一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射雜交瘤,十幾天后可以看到實體瘤形成,也可以在超凈臺上無菌采摘,然后放回培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶等容器內(nèi)培養(yǎng)。如果被污染的細(xì)胞很少,比如說在96孔板上就被污染了,這時候不能進行腹腔注射,也不要進行皮下注射,否則細(xì)胞很容易被老鼠的免疫系統(tǒng)攻擊而死亡的,最好的辦法是采用脾內(nèi)注射的方法進行,同時在腹腔內(nèi)用IFA或石蠟油致敏,十幾天后,同樣可以形成腹水,其中即含有干凈的雜交瘤細(xì)胞。 如果擔(dān)心小鼠會受到微生物感染,可以在培養(yǎng)基中先加入高濃度的抗生素,然后連同抗生素一起注射到小鼠體內(nèi)。


如果確定細(xì)胞污染極其嚴(yán)重,并且細(xì)胞已大面積死亡,建議放棄,迅速做好環(huán)境清潔工作,對細(xì)胞操作間作徹底消毒,重新做融合而獲得新的細(xì)胞株,不可因小失大造成其它的細(xì)胞也被污染。


9.  為什么我的雜交瘤細(xì)胞不能制備腹水或者制備的腹水中沒的抗體或腹水沒有效價?


答: 不能制備腹水的原因大部份是人為的原因:


(1)致敏不正確,例如使用了不正確的致敏劑,或者致敏時間與接種雜交瘤的時間相差太久。


(2)雜交瘤的接種位置不正確,沒有打到腹腔,而是打到了皮下。


(3)接種的雜交瘤細(xì)胞數(shù)量太少或者細(xì)胞狀態(tài)不好。一般不應(yīng)少于10萬個細(xì)胞,建議在100萬個細(xì)胞左右為宜。


(4)制備腹水小鼠的種系與參與融合的細(xì)胞來源的動物種系相差太遠(yuǎn),以至制備腹水的小鼠對雜交瘤有強大的免疫反應(yīng)將其殺死,建議更換小鼠品系重新接種。


對于腹水沒有效價,可能的原因:


(1)制備腹水的雜交瘤極不穩(wěn)定,打到小鼠身上之前就失去抗體分泌能力或者打到腹腔內(nèi)就失去了分泌能力。


(2)致敏小鼠時采用了錯誤的致敏劑,如使用了弗氏完全佐劑,這時即使不打雜交瘤,小鼠也會產(chǎn)生腹水。


(3)極其罕見的情況,就是此雜交瘤生產(chǎn)的抗體可以與小鼠體內(nèi)的分子相互作用,于是雜交瘤產(chǎn)生的抗體被小鼠的相關(guān)蛋白中和,這種情況下,小鼠的身體可能會出現(xiàn)明顯的異常。


(4)檢測腹水效價的實驗方案有問題,或者腹水稀釋比過大。

10.  免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

答:有時不能獲得滿意的抗血清,可從下列幾方面找原因,并改進之。

(1)免疫動物的種屬及品系是否合適,可考慮改變動物的種屬或品系,或擴大免疫動物的數(shù)量。

(2) 抗原質(zhì)量是否良好,可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號,也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu),或改進提取方法。

(3) 制備的免疫原是否符合要求,可從偶聯(lián)劑,載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮,并加以改進。

(4) 所用的佐劑是否合適,乳化是否完全,可改用其它佐劑,或加強乳化。

(5) 免疫的方法、劑量,加強免疫的間隔時間和次數(shù),免疫的途徑是否合適。

(6) 動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng),如營養(yǎng)(飼料、飲水)、環(huán)境衛(wèi)生(通風(fēng)、采光、溫度)是否符合要求,動物的健康情況是否良好等。

11.  制備單克隆抗體影響因素、失敗原因分析

答:由于制備McAb的實驗周期長,環(huán)節(jié)多,所以影響因素就比較多,稍不注意就會造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素有:

(1)污染: 包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之,以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清,此外,其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室,要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進行支原體的檢查,查出污染源應(yīng)及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法,將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠的腹腔,待長出腹水或?qū)嶓w瘤時,取出分離雜交瘤細(xì)胞,一般可除去支原體污染。

(2)融合后雜交瘤不生長, 在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素:

PEG有毒性或作用時間過長。

牛血清的質(zhì)量太差,用前沒有進行嚴(yán)格的篩選。

骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。

HAT有問題,主要是A含量過高或HT含量不足。


(3)雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體: 融合后有細(xì)胞生長,但無抗體產(chǎn)生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變,變成A抵抗細(xì)胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱,免疫效果不好。 對于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮?,可能是?xì)胞支原體污染,或非抗體分泌細(xì)胞克隆競爭性生長,從而 抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”,可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要:

要大量保持和補充液氮凍存的細(xì)胞原管。

要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長狀況。

要定期進行再克隆。

三不要:

不要讓細(xì)胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢,壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。


(4)雜交瘤細(xì)胞難以克隆化

可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān),或由于細(xì)胞有支原體污染,使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化,應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。


本文關(guān)鍵詞:單抗制備常見問題分析

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