1.  為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？

答：可以從這幾個方面一一考慮：

（1）設(shè)計的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計抗原，設(shè)計抗原時盡量選取目標(biāo)蛋白特異性的序列，可以設(shè)計為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對于后一種情況，首先確認(rèn)小分子物質(zhì)是否已經(jīng)正確地和載體蛋白偶聯(lián)，如果偶聯(lián)沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，一般來說KLH是所有載體中較為優(yōu)先考慮的蛋白。

（2）免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果，詳細(xì)請參考本站有關(guān)動物免疫的部份，實際操作中的相關(guān)程序與本站推薦的程序相差盡里不超過50%的偏差。

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證完全有效，此時可以考慮更換佐劑嘗試。

（4）免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導(dǎo)致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應(yīng)答。一般來說，實際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。

（5）免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內(nèi)免疫方法，具體操作本站上也有詳細(xì)的講解。

（6）測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開始作梯度稀釋。對于小分子物質(zhì)，效價達到1：2000仍可視為免疫成功。

2.  為什么融合后細(xì)胞不長或者融合后克隆很少？

答：可以從這幾個方面考慮：

（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應(yīng)該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時應(yīng)該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。

（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。

（4）未正確制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。參見本站有關(guān)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備的部份。

（5）接種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

（6）融合后，未及時轉(zhuǎn)移或稀釋細(xì)胞。有人在做融合后喜歡把融合的細(xì)胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，然后再滴到96孔板上。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時間過長，也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。

（7）細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。

（8）細(xì)胞培養(yǎng)條件不正確，確保細(xì)胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。

（9）其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩亍Ｔ斠姳菊居嘘P(guān)細(xì)胞融合的部份。

3.  為什么融合后得不到陽性克??？

答：可能的原因：

（1）動物未免疫成功就進行了融合。具體解決方法參照本頁面第1個問題。

（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁面第2個問題。

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標(biāo)板上，再如使用了不適當(dāng)?shù)亩沟戎T多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份與細(xì)胞培養(yǎng)條件中的物質(zhì)相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結(jié)構(gòu)相同或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反應(yīng)。舉個簡單的例子，如果需要制備抗BSA 的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結(jié)合，最后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結(jié)果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養(yǎng)基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

（5）其它所有能影響ELISA等相關(guān)篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關(guān)ELISA實驗的講解與討論。

4.  為什么我的細(xì)胞生長很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)實驗，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實血清質(zhì)量。

（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方是否正確。

（3）制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見本頁面第二個問題。

（4）其它問題，可以參考本頁面第二個問題。

5.  我的克隆原來是陽性的，為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了？

答：首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩(wěn)定的，確實容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當(dāng)細(xì)胞移到新環(huán)境中生長，如從小孔擴大到大孔，或者復(fù)蘇操作時，更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮?。但是也有一些辦法盡量減少陽性變?yōu)殛幮缘霓k法。一般可以從這幾個方面加以注意：

（1）永遠(yuǎn)保證細(xì)胞處在最佳的生長環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長期不換，一般來說，當(dāng)細(xì)胞增長到一定密度的時候，培養(yǎng)基就開始變顏色，這個時候就要準(zhǔn)備換培養(yǎng)基了，除了換培養(yǎng)基，同時應(yīng)該控制好細(xì)胞的密度，可以吹走過多的細(xì)胞，使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。

（2）對于重要的細(xì)胞株，每一步都把陽性的細(xì)胞保種。

（3）不要過于頻繁操作細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。

（4）對于傳代次數(shù)較多的細(xì)胞株需要經(jīng)常進行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。

（5）當(dāng)細(xì)胞被支原體等微生物污染，也會發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的情況。

6.  為什么我做亞克隆后長不出克隆來？

答：亞克隆失敗的原因和克隆不長的原因類似，但是除此之外，也還有一些獨特的原因。

（1）亞克隆時，原始孔里的細(xì)胞狀態(tài)不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細(xì)胞活性很差，以至于長不出克隆。

（2)亞克隆時，沒有按照正確的數(shù)量取出細(xì)胞，在本站有關(guān)亞克隆操作的頁面上提到過，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞，或有效細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞，則也可能出現(xiàn)長不出克隆的結(jié)果。

（3）未添加飼養(yǎng)層細(xì)胞。單個細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中極難培養(yǎng)，如果不添加飼養(yǎng)層細(xì)胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的，但是HT確實可以加快細(xì)胞生長，改善細(xì)胞生長狀態(tài)。

（5）使用無血清培養(yǎng)基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養(yǎng)基制備單抗，但是在某些血清可能干預(yù)篩選步驟的實驗的時候，可能會選用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養(yǎng)基中，單個細(xì)胞是很難長成克隆的。最好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，等克隆長出后再把培養(yǎng)基徹底更換為無血清培養(yǎng)基。

7.  為什么我凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？

答：這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題。 對于凍存過程，需要注意：

（1）凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵，一個良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細(xì)胞傾刻死亡。目前認(rèn)為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細(xì)胞最終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細(xì)胞中毒而亡。如果使用第二個配方，注意一定要用養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，而盡量不要用一般的完全培養(yǎng)基，而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長自己沒有親自試過，不發(fā)表評論。如果新手確實對這個沒把握，市場上也有商品化的凍存液，買回來按照說明書操作就OK了。

（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細(xì)胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細(xì)胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機會就明顯會下降。

（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細(xì)胞是最理想的。如果條件簡易，可以把細(xì)胞放在4 ℃半小時左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時，最后轉(zhuǎn)入-80 ℃放置過夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現(xiàn)在市場上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細(xì)胞放進去，然后直接放-80 ℃就行，等時間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。

（4）細(xì)胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實這是錯誤的。有人認(rèn)為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會進入凍存管，最終可能造成細(xì)胞污染。

（5）保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)，并且沒有被污染。

對于復(fù)蘇過程，需要注意：

（1）快速。為了防止升溫中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復(fù)蘇，并不斷晃動凍存管。

（2）復(fù)蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復(fù)蘇的細(xì)胞被污染。

（3）有的人復(fù)蘇細(xì)胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養(yǎng)體系里，容易對細(xì)胞造成毒害，因此強烈建議將融化的細(xì)胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養(yǎng)基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。

8.  為什么我的細(xì)胞總是污染？如何可以救活污染的細(xì)胞？

答：養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)污染，幾乎是每個細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)員容易出現(xiàn)的問題。要防止細(xì)胞污染，無非就是保證培養(yǎng)環(huán)境無污染，保證所用的所有試劑都無污染源，同時提高操作時的警惕性，這些基本的知識這里就不再廢話了。下面講一講如何挽救一株已經(jīng)被污染的細(xì)胞株。

（1）體外用抗生素消滅。一般來說，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被微生物污染，應(yīng)該馬上進行處理，也許還有一線挽救的機會。 但是這種挽救不是盲目的，首先應(yīng)該決斷是哪一類生物造成的污染。細(xì)胞的污染大致可以分三類：細(xì)菌污染、真菌污染和支原體污染。 在顯微鏡下仔細(xì)觀察，這三種微生物污染區(qū)別還是比較明顯的：如果有大量運動的微生物，且形態(tài)較大，輪廓清晰可見，呈較大幅度運動，并且培養(yǎng)基在短時間內(nèi)變酸，則很可能是細(xì)菌污染；如果在顯微鏡下觀察有典型的斑狀或絲狀微生物（注意與塑料屑、棉花屑和琉璃纖維區(qū)別開），基本上看不到明顯的運動，則很可能是真菌污染；如果看不到明顯的微生物，并且培養(yǎng)基沒有明顯的顏色上的變化，而細(xì)胞狀態(tài)很差，細(xì)胞邊緣極其不光滑，而且細(xì)胞又莫名其妙地死亡或生長極其緩慢，則有可能為支原體污染，但不能下明確的結(jié)論，如果非常需要知道是否為支原體污染可以使用相關(guān)的試劑盒進行檢測。 對于細(xì)菌或真菌的污染，可以先把細(xì)胞收集起來，用干凈的培養(yǎng)基洗滌離心，交替進行幾次，再把洗干凈的細(xì)胞放在新的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶等容器內(nèi)，加高濃度的抗生素培養(yǎng)，同時強烈建議加入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，以輔助消除微生物。對于細(xì)菌污染，可以把青霉素的濃度提高至10倍左右，鏈霉素濃度提高至5-10 倍，也可以用10倍濃度的卡那霉素替代鏈霉素。 對于真菌污染，可以在培養(yǎng)基中加入約5 ug/ml的咪康唑（注射用達克寧）抑制。 對于這兩種情況的污染，采用上述方法處理后，待細(xì)胞稍有好轉(zhuǎn)，并且沒有發(fā)現(xiàn)更大規(guī)模的污染時，需要盡快重復(fù)上面的處理步驟。需要注意的是，此時細(xì)胞生長受抗生素的影響比較大故而生長很慢。如果多次傳代均未發(fā)現(xiàn)污染復(fù)發(fā)，可以慢慢降低抗生素濃度直至常規(guī)濃度，確定是否完全根除污染。最好進行一次有限稀釋的亞克隆操作，以獲得更加純凈的細(xì)胞株。 而對于支原體污染，則比較麻煩，一般的抗生素是很難解決的，對于輕度的污染，可以試試使用60 ug/ml的泰樂菌素和10 ug/ml左右的環(huán)丙沙星交替處理。如果得到明顯的緩解，建議馬上做亞克隆操作，看看是否得到污染根除的細(xì)胞株，如果此方法無效，則不能單純利用抗生素來解決污染問題。

（2）體內(nèi)法。這個辦法很簡單，原理就是動物體有強大的免疫系統(tǒng)，一般的微生物都可以被動物體消滅。具體操作和制備腹水的方法完全一樣，即先用IFA或石蠟制敏小鼠，數(shù)天后腹腔注射污染的雜交瘤。如果情況緊急，致敏當(dāng)天注射雜交瘤也行。一般十天后小鼠產(chǎn)生腹水，在超凈臺無菌采出腹水，其中即含有大量的雜交瘤細(xì)胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射雜交瘤，十幾天后可以看到實體瘤形成，也可以在超凈臺上無菌采摘，然后放回培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶等容器內(nèi)培養(yǎng)。如果被污染的細(xì)胞很少，比如說在96孔板上就被污染了，這時候不能進行腹腔注射，也不要進行皮下注射，否則細(xì)胞很容易被老鼠的免疫系統(tǒng)攻擊而死亡的，最好的辦法是采用脾內(nèi)注射的方法進行，同時在腹腔內(nèi)用IFA或石蠟油致敏，十幾天后，同樣可以形成腹水，其中即含有干凈的雜交瘤細(xì)胞。 如果擔(dān)心小鼠會受到微生物感染，可以在培養(yǎng)基中先加入高濃度的抗生素，然后連同抗生素一起注射到小鼠體內(nèi)。

如果確定細(xì)胞污染極其嚴(yán)重，并且細(xì)胞已大面積死亡，建議放棄，迅速做好環(huán)境清潔工作，對細(xì)胞操作間作徹底消毒，重新做融合而獲得新的細(xì)胞株，不可因小失大造成其它的細(xì)胞也被污染。

9.  為什么我的雜交瘤細(xì)胞不能制備腹水或者制備的腹水中沒的抗體或腹水沒有效價？

答： 不能制備腹水的原因大部份是人為的原因：

（1）致敏不正確，例如使用了不正確的致敏劑，或者致敏時間與接種雜交瘤的時間相差太久。

（2）雜交瘤的接種位置不正確，沒有打到腹腔，而是打到了皮下。

（3）接種的雜交瘤細(xì)胞數(shù)量太少或者細(xì)胞狀態(tài)不好。一般不應(yīng)少于10萬個細(xì)胞，建議在100萬個細(xì)胞左右為宜。

（4）制備腹水小鼠的種系與參與融合的細(xì)胞來源的動物種系相差太遠(yuǎn)，以至制備腹水的小鼠對雜交瘤有強大的免疫反應(yīng)將其殺死，建議更換小鼠品系重新接種。

對于腹水沒有效價，可能的原因：

（1）制備腹水的雜交瘤極不穩(wěn)定，打到小鼠身上之前就失去抗體分泌能力或者打到腹腔內(nèi)就失去了分泌能力。

（2）致敏小鼠時采用了錯誤的致敏劑，如使用了弗氏完全佐劑，這時即使不打雜交瘤，小鼠也會產(chǎn)生腹水。

（3)極其罕見的情況，就是此雜交瘤生產(chǎn)的抗體可以與小鼠體內(nèi)的分子相互作用，于是雜交瘤產(chǎn)生的抗體被小鼠的相關(guān)蛋白中和，這種情況下，小鼠的身體可能會出現(xiàn)明顯的異常。

（4）檢測腹水效價的實驗方案有問題，或者腹水稀釋比過大。

10.  免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

答：有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。

（1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量。

（2） 抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進提取方法。

（3） 制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進。

（4） 所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

（5） 免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

（6） 動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

11.  制備單克隆抗體影響因素、失敗原因分析

答：由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素有：

（1）污染： 包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。

（2）融合后雜交瘤不生長， 在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素：

PEG有毒性或作用時間過長。

牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進行嚴(yán)格的篩選。

骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。

HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

（3）雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體： 融合后有細(xì)胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 對于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮?，可能是?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競爭性生長，從而 抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要：

要大量保持和補充液氮凍存的細(xì)胞原管。

要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長狀況。

要定期進行再克隆。

三不要：

不要讓細(xì)胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

（4）雜交瘤細(xì)胞難以克隆化

可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。

本文關(guān)鍵詞：單抗制備常見問題分析